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    第三代测序技术以PacBio公司的SMRT技术和OxfordNanoporeTechnologies公司的纳米孔单分子技术为**的新一代测序技术被称为第三代测序技术，与前两代测序技术相比，其比较大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，并且理论上可以测定无限长度的核酸序列。PacBio技术平台SMRT芯片是一种带有很多ZMW孔的厚度为100nm的金属片，四川多基因联合检测迈杰转化医学NGS平台创新服务，将DNA聚合酶、待测序列和不同荧光标记的dNTP放入ZMW孔的底部。荧光标记的位置是磷酸基团，四川多基因联合检测迈杰转化医学NGS平台创新服务，当一个dNTP被添加到合成链上的同时，它会进入ZMW孔的荧光信号检测区，根据荧光的种类就可以判定dNTP的种类，从而获得核酸的碱基序列信息。ZMW孔PacBio平台测序原理每个ZWM孔只允许一条DNA模板进入，DNA模板进入后，DNA聚合酶与模板结合，四川多基因联合检测迈杰转化医学NGS平台创新服务，加入4种不同颜色荧光标记4种dNTP，其通过布朗运动随机进入检测区域并与聚合酶结合从而延伸模板，与模板匹配的碱基生成化学键的时间远远长于其他碱基停留的时间，因此统计荧光信号存在时间的长短，可区分匹配的碱基与游离碱基。通过统计4种荧光信号与时间的关系，即可测定DNA模板序列。 迈杰转化医学设有病原体检测平台Qiastat-Dx进行呼吸道及胃肠道病原体检测。四川多基因联合检测迈杰转化医学NGS平台创新服务

    1、Illumina原理：桥式PCR+4色荧光可逆终止+激光扫描成像主要步骤：①DNA文库制备——超声打断加接头②Flowcell——吸附流动DN**段③桥式PCR扩增与变性——放大信号④测序——测序碱基转化为光学信号优势劣势：Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换。而读长短（200bp-500bp）也让其应用有所局限。2、Roche454油包水PCR+4种dNTP车轮大战+检测焦磷酸水解发光主要步骤：①DNA文库制备——喷雾打断加接头②乳液PCR——注水入油**PCR③焦磷酸测序——磁珠入孔，焦磷酸信号转化为光学信号优势劣势：454技术优势测序读长较长，平均可达400bp，缺点是无法准确测量类似于PolyA的情况时，测序反应会一次加入多个T，可能导致结果不准确。也正是由于这一原因，454技术会在测序过程中引入插入和缺失的测序错误。3、IonTorrent原理油包水PCR+4种dNTP车轮大战+微电极PH检测主要步骤：①DNA文库制备——喷雾打断加接头②乳液PCR——注水入油**PCR③微电极pH检测——磁珠入池记录pH优势劣势：IonTorrent与454相比，主要差异在测序中，IonTorrent不需要昂贵的物理成像设备，成本相对较低体积较小。四川多基因联合检测迈杰转化医学NGS平台创新服务MSH2抗体试剂 苏苏械备20180568号.

    ，需将磁珠固定在特制的PTP平板上。这种平板上含有许多直径约为44μm的小孔，每个小孔*能容纳一个磁珠，通过这种方法来固定每个磁珠的位置。启动测序反应后，每次向PTP平板中加入一种dNTP，如果能与待测序列配对，则会在碱基连接在模板上之后释放焦磷酸，焦磷酸通过ATP硫酸化学酶***荧光素酶产生荧光，通过PTP板另一侧的CCD照相机记录荧光，从而确定目的模板的核酸序列。ABI/SOLiDABI/SOLiD技术原理SOLiD测序技术与454技术的原理比较类似，同样是采用油包水的方式进行EmulsionPCR。不同之处在于SOLiD形成的小水滴要比454系统小得多，只有1μm大小，并且在PCR扩增的同时对扩增产物的3'端进行修饰，为下一步的测序做准备。在PCR完成之后，SOLiD技术进行测序时，其反应底物不是dNTP也不是ddNTP，而含有8个碱基的单链荧光探针混合物，在测序时，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对，不同的探针的5'末端分别标记不同颜色的荧光染料，每两个碱基确定一个荧光信号，相当于一次能决定两个碱基，因此，这种测序方法也被称为两碱基测序法。

    同时操作更为简单，整个上机测序可在（文库构建时间除外）。其劣势在于芯片的通量并不高，非常适合小基因组和外显子验证的测序。小结：二代测序相比一代测序大幅降低了成本，保持了较高准确性，并且大幅降低了测序时间，将一个人类基因组从3年降为1周以内，但在序列读长方面比起***代测序技术则要短很多，这也给三代测序提供了发展空间。三、独辟蹊径补空缺三代测序：单分子测序背景：测序技术经过***代、第二代的发展，读长从一代测序的近1000bp，降到了二代测序的几百bp，通量和速度大幅提升，那么第三代测序的发展思路在于保持二代测序的速度和通量优势同时，弥补其读长较短的劣势。三代测序与前两代相比，**大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。1、Oxfordnanopore纳米孔+电流检测技术原理：该技术设计了一种特殊的纳米孔，孔内共价结合有分子接头，**终得到电信号而不是光信号或pH信号的测序技术。当DNA碱基通过纳米孔时，电荷将发生变化，因而短暂地影响流过纳米孔的电流强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的），灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。优势劣势：①读长很长，大约在几十kb，甚至100kb；②错误率目前相比较高。迈杰转化医学为创新药企开展全球多中心临床试验研究，提供中心实验室检测及伴随诊断开发服务。

    降低引物的扩增效率，也需要重新设计并合成引物。3、初次复合扩增时，各个引物在反应体系中的浓度均为μm；之后对引物浓度进行调整，获得进行pcr扩增时各个引物的**佳浓度。经过上述步骤，获得引物组合。引物组合由120条引物组成，用于检测68个基因座。各个基因座的名称、扩增基因座对应的引物名称和引物的核苷酸序列依次见表1中第1列、第2列和第3列。进行pcr扩增时各个引物的**佳浓度见表1中第5列。表1各个基因座对应的引物在hg38人类参考基因组(hg38人类基因组的信息见网址./goldenpath/hg38/bigzips/)中的pcr扩增产物的长度和核苷酸序列详见表2。各个str基因座的pcr扩增产物的长度范围分布见图1。表2三、基于二代测序技术检测68个基因座的试剂盒的制备基于二代测序技术检测68个基因座的试剂盒包括引物混合物；引物混合物由步骤二制备的120条引物混合而成。实施例2、实施例1制备的试剂盒检测标准品2800m的str分型及其应用一、实施例1制备的试剂盒检测标准品2800m的str分型1、dna样本准备取标准品2800m，用超纯水稀释，获得浓度为1ng/μl的标准品2800m水溶液。2、pcr扩增以标准品2800m水溶液为模板，采用实施例1步骤三制备的引物混合物进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。PMS2抗体试剂 苏苏械备20180570号.黑龙江多组学迈杰转化医学NGS平台口碑推荐

MSH6抗体试剂 苏苏械备20180569号.四川多基因联合检测迈杰转化医学NGS平台创新服务

    目前市场上**成功的商业化多重PCR建库技术是ThermoFisher公司的Ampliseq技术，该技术可以在同一孔反应中完成上千对引物的扩增，使得多个靶标区域的富集可以通过一次PCR反应完成，随后加上IonTorrent测序平台的通用接头建好文库用于二代测序。然而，这个产品存在**大的缺陷是客户定制化的panel设计生产周期较长，需要两到三个月，严重的增加了时间成本；并且每个样本的建库费用高达1000-2000元，致使其经济成本极高；另外该试剂盒只适用于IonTorrent测序平台，受平台因素影响大，亦不利于测序费用的降低。技术实现要素：鉴于以上问题，本发明提供了一种基于多重PCR的二代测序建库技术，该技术可以有效的解决Ampliseq试剂盒存在的问题，对于客户定制化的panel设计生产周期只需要两周，并且可以极大的降低单个样本建库的成本，且在IonTorrent和Illumina测序平台都通用。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明中用到了两轮多重PCR来建库。首先针对每个靶标区域或者靶标位点，需要设计两条特异性引物，一条引物在另一条引物的3’下游100-150bp的位置，处于下游的引物在5’端加上二代测序平台通用的测序接头。上游的引物OP用于***轮多重PCR。四川多基因联合检测迈杰转化医学NGS平台创新服务

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